Zytologiekurs

Diese Seiten wurden als Begleitskript zum praktischen Kurs der mikroskopischen Hämatologie am Campus Virchow-Klinikum der Charité – Universitätsmedizin Berlin erstellt.

Studenten kann der Kurs die Hilfe bieten, sich einen ersten Überblick über die Befundung eines Differentialblutbildes oder eines Knochenmarkausstriches zu verschaffen. Außenstehende können einen Einblick in die faszinierende Welt der Zytologie gewinnen.

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Molekularbiologische Methoden

Hierbei handelt es sich um Methoden, die auf DNA-Ebene arbeiten.

Am bekanntesten sind der Southern-Blot und die Polymerase-Kettenreaktion. Beim Southern-Blot wird die DNA des Patienten zunächst mit Restriktionsenzymen geschnitten und dann auf einem Gel der Größe nach separiert. Die DNA kann dann mit markierten Gensonden untersucht werden. Die Polymerase-Kettenreaktion beruht auf der in-vitro-Vervielfältigung von DNA mittels spezifischer Oligonukleotide und einer hitzestabilen DNA-Polymerase.

Immunzytologische Methoden

Mit diesen immunologischen Methoden werden charakteristische Antigene auf und in den Blutzellen nachgewiesen.

Die Methoden beruhen auf der Spezifität zwischen Antigen und Antikörper. Durch die Entwicklung monoklonaler Antikörper haben diese Untersuchungen eine große Erweiterung erfahren. Mit monoklonalen Antikörpern lassen sich auch Antigene nachweisen, die nicht mit chemischen Methoden isoliert werden können. Die Antikörper gegen Leukozyten-Antigene werden durch CD-Nummern charakterisiert. CD bedeutet "cluster of differentiation". Einige wichtige CD-Nummern sind:

  • CD3 = T-Zellen
  • CD4 = T-Helfer-Lymphozyten
  • CD8 = T-Suppressor-Lymphozyten und cytotoxische T-Zellen
  • CD10 = calla Antigen
  • CD13 und CD 33 = myeloische Zellen
  • CD19, CD 20 und CD 22 = B-Zellen
  • CD45 = Pan-Leukozyten-Antigen
  • CD61 =Thrombozyten und Megakaryozyten
  • CD34 = Stammzellen und Progenitorzellen.

Es werden drei verschiedene Methoden eingesetzt, um Antigene mit immunologischen Methoden auf Blutzellen nachzuweisen. Die älteste Methode ist die Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Bei dieser Methode werden die Lymphozyten (und Monozyten) über einen Dichte - Gradienten isoliert und dann mit einem Antikörper inkubiert. Die Bindung des Antikörpers an seine entsprechenden Blutzellen wird dadurch nachgewiesen, dass der Antikörper mit Fluorescein markiert ist. Dieser Stoff hat die Eigenschaft, dass er im unsichtbaren UV-Licht gelb aufleuchtet. Betrachtet man die Zellen nun durch ein Fluoreszenz-Mikroskop, das mit UV-Licht beschickt wird, so leuchten die Zellen gelb auf, an die sich der fluoreszein-markierte Antikörper gebunden hat. So kann man den Prozentsatz der Zellen ermitteln, die ein bestimmtes Antigen tragen, für das der Antikörper spezifisch ist.

Bei der Durchflusszytometrie werden Zellen, an die sich ein Fluorescein-markierter Antikörper gebunden hat, über eine Fotozelle automatisch registriert. Mit dieser Methode können viel größere Zellzahlen untersucht und ausgewertet werden. Die Auswertung ist objektiver als bei der Fluoreszenz-Mikroskopie. Ein Durchflusszytometer ist allerdings wesentlich teurer als als ein Fluoreszenz-Mikroskop.

Nur ein Lichtmikroskop wird bei den immunzytochemischen Methoden benötigt. Dabei können Blut- oder Knochenmarkausstriche untersucht werden. Der Ausstrich wird dabei mit einer Lösung überschichtet, die einen Antikörper enthält, der mit einem Enzym (Peroxidase oder alkalische Phosphatase) markiert ist. Der Antikörper bindet sich spezifisch an die entsprechenden Zellen. Anschließend wird das Enzym zytochemisch nachgewiesen. Die positiven Zellen sind an ihrer Gelbfärbung (bei der Immunperoxidase) bzw. Rotfärbung (bei der immunalkalischen Phosphatase) zu erkennen. Die immunzytochemischen Methoden sind arbeitsaufwendiger als Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie.

Beckenkammstanze

Das Knochenmark kann auch durch eine Beckenstanze untersucht werden.

Bei der Beckenstanze wird mit einer Jamshidi-Nadel aus dem Beckenkamm ein Stück Knochenmark herausgestanzt, entkalkt, eingebettet, geschnitten und gefärbt. Ein beurteilbares Präparat liegt nach 4 bis 5 Tagen vor. Bei dieser Methode wird ein histologisches Präparat gewonnen, das eine Aussage über den echten Zellgehalt im Knochenmark ermöglicht. Die Einzelheiten der Zellen sind jedoch nicht so gut zu erkennen wie bei der Knochenmarkaspiration. Beide Methoden ergänzen sich gegenseitig. Besonders wenn die Knochenmarkaspiration eine punctio sicca (trockene Punktion) ergibt, führt die Beckenstanze weiter.

Knochenmarkaspiration

Die Untersuchung des Knochenmarks erfolgt entweder durch Punktion (Aspiration) oder durch eine Beckenstanze.

Bei der Knochenmarkaspiration wird aus dem Sternum oder aus dem Beckenkamm Knochenmark herausgesaugt, und aus den Knochenmarkbröckeln werden Ausstriche hergestellt und nach Pappenheim gefärbt. Etwa eine Stunde nach der Punktion kann bereits ein fertiges Präparat vorliegen. Es handelt sich um ein zytologisches Präparat, in dem die Einzelheiten der Zellen besonders gut zu erkennen sind. Die Beurteilung des Zellgehaltes in einem solchen Präparat ist jedoch nicht immer repräsentativ für den Zellgehalt des Knochenmarks. Bei der Auswertung des Knochenmarkpunktats sind folgende Punkte zu berücksichtigen: Zellgehalt, Verhältnis Granulopoese zu Erythropoese (G/E-Index), Ausreifung der Erythropoese, Ausreifung der Granulopoese, Gehalt an Myeloblasten, Gehalt an Megakaryozyten, Gehalt an Lymphozyten und Plasmazellen.

Zytochemische Untersuchungen

Bei diesen Methoden werden Enzyme in den Blutzellen nachgewiesen, um diese Zellen besser zu charakterisieren.

Die wichtigste zytochemische Untersuchung ist die Peroxidasereaktion. Dabei wird ein Blutausstrich fixiert und mit einer Lösung von Diaminobenzidin und H202 überschichtet. In den Zellen, die Peroxidase enthalten, erfolgt eine Umwandlung des Diaminobenzidins in einen gelben Farbstoff. Betrachtet man den Ausstrich anschließend unter einem Mikroskop, so erkennt man die Peroxidase-positiven Zellen an einer Gelbfärbung. Peroxidase-positiv sind die Zellen der Granulopoese mit Ausnahme von Myeloblast-I. Auch die Monozyten können schwach Peroxidase-positiv sein.

Neben der Peroxidase-Reaktion ist auch die Esterase-Reaktion von praktischer Bedeutung. Dabei wird ein fixierter Blutausstrich mit einer Lösung von α-Naphthylacetat überschichtet. Das Reaktionsprodukt wird durch ein Kupplungssalz in einen braunen Farbstoff verwandelt. Stark positiv sind vor allem Monozyten und Makrophagen.

Die PAS-Reaktion (Perjodsäure-Schiff-Reaktion) hat an Bedeutung verloren. Sie dient zur Unterscheidung von Myeloblasten und Lymphoblasten.

Mikroskopisches Differentialblutbild

Ein Tropfen EDTA-Blut wird auf einen Objektträger ausgestrichen und getrocknet.

Um einen guten Blutausstrich herzustellen, bedarf es großer Übung. Die Färbung erfolgt nach der Methode von Pappenheim (May-Grünwald-Giemsa-Färbung). Unter dem Mikroskop werden die Erythrozyten und Thrombozyten beurteilt; außerdem werden 100 Leukozyten differenziert.

Hämoglobinbestimmung im Blut

Bei dieser sehr genauen Methode erfolgt die Bestimmung der Hämoglobinkonzentration mit dem Fotometer.

Nach Hämolyse der Erythrozyten wird das Hämoglobin in Cyanhämoglobin umgewandelt. Normalerweise werden bei der Frau über 120 g/l und beim Mann über 130 g/l Hämoglobin gemessen.

Blutzellzählung

Früher erfolgte die Zählung der Blutkörperchen in der Zählkammer. Wegen ihrer Ungenauigkeit wird diese Methode heute nur noch selten angewendet.

Die Zellzählung erfolgt heute elektronisch nach dem Widerstandsmeßprinzip. Jede Blutzelle ergibt dabei einen elektrischen Impuls, wobei die Impulsgröße vom Zellvolumen abhängig ist. Die Gesamtzahl der Impulse entspricht der Erythrozytenzahl. Die Leukozytenzahl wird bestimmt nach der Hämolyse der Erythrozyten. Die Thrombozyten werden aufgrund ihres kleinen Volumens von den anderen Blutzellen unterschieden und gezählt.

Aufgrund ihres unterschiedlichen Volumens werden die Leukozyten in kleine, mittlere und große Leukozyten unterteilt. Bei gesunden Probanden entsprechen die kleinen Leukozyten den Lymphozyten und die großen Leukozyten den segmentkernigen neutrophilen Granulozyten. Die mittelgroßen Leukozyten entsprechen den Monozyten. Mit dieser Methode können abnorme Anteile der verschieden großen Leukozytenarten erkannt werden. Eine genaue Benennung krankhafter Zellen ist jedoch mit dieser Methode nicht möglich.

Dies erfordert die mikroskopische Differenzierung eines gefärbten Blutausstriches. Normalerweise findet man bei der Frau über 4 Mio Erythrozyten/µl und beim Mann über 4,5 Mio Erythrozyten/µl sowie 4.000–9.000 Leukozyten/µl und 150.000–300.000 Thrombozyten/µl.

Der Hämatokrit gibt den Anteil der Erythrozyten am Gesamtblut an. Früher wurde diese Größe in der Hämatokrit-Zentrifuge bestimmt. Heute wird der Hämatokrit meist aus Erythrozytenzahl und MCV errechnet.

Die Erythrozytenindizies sind abgeleitete Größen, die sich aus Erythrozytenzahl, Hämoglobin-Konzentration und Hämatokrit ergeben.

Mittleres korpuskuläres Hämoglobin (MCH) = Hämoglobin - Konzentration / Erythrozytenzahl (Normalbereich 28–35 pg)

Mittleres korpuskuläres Volumen (MCV) = Hämatokrit / Erythrozytenzahl (Normalbereich 80–100 fl)

Mittlere korpuskuläre Hämoglobin-Konzentration (MCHC) = Hämoglobin - Konzentration / Hämatokrit (Normalbereich 310–360 g/l)

Das MCHC ist die Hämoglobin-Konzentration in den Erythrozyten, während die Hämoglobin-Konzentration im Gesamtblut bestimmt wird.